Динамика изменений морфологии нейрональной сети и развития митохондрий в механически поврежденной первичной культуре нейронов
Ключевые слова:
первичная культура нейронов, мозжечок, митохондрии, митохондриальный потенциал, механическая травма, цейтраферная микроскопия
Аннотация
Цель исследования. На модели первичной культуры нейронов изучить влияние повреждения (механическая травма) на: 1 – морфологию нейрональной сети и 2 – динамику образования митохондрий в процессе развития культуры. Методика. Развитие первичной культуры нейронов из мозжечка 7-дневных крыс регистрировали с интервалом 20 мин в течение 2,5 нед со дня посева клеток с помощью системы прижизненной визуализации и анализа IncuCyte ZOOM, снабженной 20х объективом. Изображения сомы индивидуальных нейронов и развитие нейритов записывали в проходящем свете. Образование митохондрий и генерацию в них электрического трансмембранного потенциала (ΔΨm) отслеживали с помощью потенциал-чувствительного флуоресцентного зонда TMRM (20 нМ), который непрерывно присутствовал в культуре с момента посадки. Механическую травму мозга моделировали нанесением царапины шириной ≈ 1 мм по монослою клеток спустя 23 ч после посадки. Результаты. Морфологические изменения развивающейся первичной культуры нейронов (суммарная длина нейритов, относительная площадь сомы) характеризуются тремя фазами, отличающимися по кинетике и продолжительности. TMRM влиял на продолжительность и амплитуду фаз, не изменяя их количества. Митохондрии начинали развиваться на 4-е сут после посадки культуры и увеличение их числа и рост ΔΨm завершались после 10-14-х сут развития культуры. Заключение. Фазы развития митохондрий соотносятся с тремя фазами морфологических изменений культуры в целом. Первые 2-3 сут после посадки энергообеспечение нейрональной сети происходит, вероятно, за счет гликолиза, поскольку митохондрии не генерируют ΔΨm, достаточный для синтеза АТФ. Аксоны из неповрежденной области прорастают в поврежденную зону преимущественно в направлении нейронов, сохранившихся в зоне царапины.
Скачивания
Данные скачивания пока недоступны.
Литература
1. Flynn K.C. The cytoskeleton and neurite initiation. Bioarchitecture. 2013; 3(4): 86–109.
2. Valtorta F. and Leoni C. Molecular mechanisms of neurite extension. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1999; 354 (1381): 387–94.
3. Mukhin A.G., Ivanova S.A., Knoblach S.M. and Faden A.I. New in vitro model of traumatic neuronal injury: evaluation of secondary injury and glutamate receptor-mediated neurotoxicity. J. Neurotrauma. 1997; 14(9): 651–63.
4. Mukhin A.G., Ivanova S.A., Allen J.W. and Faden A.I. Mechanical injury to neuronal/glial cultures in microplates: Role of NMDA receptors and pH in secondary neuronal cell death. J. Neurosci. Res. 1998; 51(6): 748–58.
5. Cui X., Liu R., Liu Z., Shen X., Wang Q. and Tan X. Cationic Poly-L-Lysine-Fe2O3/SiO2 nanoparticles loaded with small interference RNA: Application to silencing gene expression in primary rat neurons. J. Nanosci. Nanotechnol. 2014; 14(4): 2810–5.
6. Payette D.J., Xie J., Shirwany N. and Guo Q. Exacerbation of Apoptosis of Cortical Neurons Following Traumatic Brain Injury in Par-4 Transgenic Mice. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2008; 1(1): 44–56.
7. Bingham D., John C.M., Panter S.S. and Jarvis G.A. Post-injury treatment with lipopolysaccharide or lipooligosaccharide protects rat neuronal and glial cell cultures. Brain Res. Bull. 2011; 85(6): 403–9.
8. Yu A.C., Lee Y.L. and Eng L.F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J. Neurosci. Res. 1993; 34(3): 295–303.
9. Desclaux M., Teigell M., Amar L., Vogel R., Gimenez y Ribotta M., Privat A. et al. A novel and efficient gene transfer strategy reduces glial reactivity and improves neuronal survival and axonal growth in vitro. PLoS One. 2009; 4(7): e6227.
10. He Y., Li H.L., Xie W.Y., Yang C.Z., Yu A.C.H. and Wang Y. The presence of active Cdk5 associated with p35 in astrocytes and its important role in process elongation of scratched astrocyte. Glia. 2007; 55(6): 573–83.
11. Khodorov B.I., Storozhevykh T.P., Surin A.M., Yuryavichyus A.I., Sorokina E.G., Borodin A.V. et al. The leading role of mitochondrial depolarization in the mechanism of glutamate-induced disruptions in Ca2+ homeostasis. Neurosci. Behav. Physiol. 2002; 32(5): 541–7.
12. Khodorov B.I., Mikhailova M.M., Bolshakov A.P., Surin A.M., Sorokina E.G., Rozhnev S.A. et al. Dramatic effect of glycolysis inhibition on the cerebellar granule cells bioenergetics. Biochem. Suppl. Ser. A Membr. Cell Biol. 2012; 6(2): 186–97.
13. Surin A.M., Khiroug S., Gorbacheva L.R., Khodorov B.I., Pinelis V.G. and Khiroug L. Comparative analysis of cytosolic and mitochondrial ATP synthesis in embryonic and postnatal hippocampal neuronal cultures. Front. Mol. Neurosci. 2013; 5: 1-15.
14. Dumollard R., Carroll J., Duchen M.R., Campbell K. and Swann K. Mitochondrial function and redox state in mammalian embryos. Seminars in Cell and Developmental Biology. 2009; 20(3): 346–53.
15. Nicholls D.G. and Ward M.W. Mitochondrial membrane potential and neuronal glutamate excitotoxicity: Mortality and millivolts. Trends in Neurosciences. 2000; 23(4): 166–74.
16. Duchen M.R., Surin A. and Jacobson J. Imaging mitochondrial function in intact cells. Methods Enzymol. 2003; 361: 353–89.
17. Сурин А.М., Шарипов Р.Р., Красильникова И.А., Бояркин Д.П., Лисина О.Ю., Горбачева Л.Р. и др. Нарушение функциональной активности митохондрий при МТТ-анализе выживаемости культивируемых нейронов. Биохимия. 2017; 82(6): 970-84.
18. Gerencser A.A., Chinopoulos C., Birket M.J., Jastroch M., Vitelli C., Nicholls D.G. et al. Quantitative measurement of mitochondrial membrane potential in cultured cells: calcium-induced de- and hyperpolarization of neuronal mitochondria. J. Physiol. 2012; 590 (12): 2845–71.
19. Trendeleva T.A., Rogov A.G., Cherepanov D.A., Sukhanova E.I., Il’yasova T.M., Severina I.I. et al. Interaction of tetraphenylphosphonium and dodecyltriphenylphosphonium with lipid membranes and mitochondria. Biochem. 2012; 77(9): 1021–8.
20. Dragunow M. High-content analysis in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 2008; 9(10): 779–88.
21. Mattiazzi Usaj M., Styles E.B., Verster A.J., Friesen H., Boone C. and Andrews B.J. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends in Cell Biology. 2016; 26(8): 598–611.
22. Daub A., Sharma P. and Finkbeiner S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 2009; 19(5): 537–543.
23. Репин В.С., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В., Горкун А.А., Зурина И.М., Кубатиев А.А. 3D технология сборки и поддержания одиночных дормантных микросфер из 2000 соматических клеток человека с их вторичной репаративной активацией in vitro. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2014; 3: 161-9.
24. Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Зурина И.М., Горкун А.А., Борзенок С.А., Никишин Д.А. и др. Технология создания мультипотентных сфероидов из мезенхимных стромальных клеток лимба для репарации поврежденных тканей глаза. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2016; 60(4): 160-7.
25. Thangnipon W., Kingsbury A., Webb M. and Balazs R. Observations on rat cerebellar cells in vitro: influence of substratum, potassium concentration and relationship between neurones and astrocytes. Dev. Brain Res. 1983; 11(2): 177–89.
26. Gallo V., Kingsbury A., Balázs R. and Jørgensen O.S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J. Neurosci. 1987; 7(7): 2203–13.
27. Budd S.L. and Nicholls D.G. A reevaluation of the role of mitochondria in neuronal Ca2+ homeostasis. J. Neurochem. 1996; 66(1): 403–11.
28. Sasaki S., Warita H., Abe K. and Iwata M. Impairment of axonal transport in the axon hillock and the initial segment of anterior horn neurons in transgenic mice with a G93A mutant SOD1 gene. Acta Neuropathol. 2005; 110(1): 48–56.
29. Popov V., Medvedev N.I., Davies H.A. and Stewart M.G. Mitochondria form a filamentous reticular network in hippocampal dendrites but are present as discrete bodies in axons: A three-dimensional ultrastructural study. J. Comp. Neurol. 2005; 492(1): 50–65.
30. Knöferle J., Ramljak S., Koch J.C., Tönges L., Asifc A.R., Michel U. et al. TGF-β 1 enhances neurite outgrowth via regulation of proteasome function and EFABP. Neurobiol. Dis. 2010; 38(3): 395–404.
31. Tonges L., Planchamp V., Koch J. C., Herdegen T., Bähr M. and Lingor P. JNK isoforms differentially regulate neurite growth and regeneration in dopaminergic neurons in vitro. J. Mol. Neurosci. 2011; 45(2): 284–93.
2. Valtorta F. and Leoni C. Molecular mechanisms of neurite extension. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1999; 354 (1381): 387–94.
3. Mukhin A.G., Ivanova S.A., Knoblach S.M. and Faden A.I. New in vitro model of traumatic neuronal injury: evaluation of secondary injury and glutamate receptor-mediated neurotoxicity. J. Neurotrauma. 1997; 14(9): 651–63.
4. Mukhin A.G., Ivanova S.A., Allen J.W. and Faden A.I. Mechanical injury to neuronal/glial cultures in microplates: Role of NMDA receptors and pH in secondary neuronal cell death. J. Neurosci. Res. 1998; 51(6): 748–58.
5. Cui X., Liu R., Liu Z., Shen X., Wang Q. and Tan X. Cationic Poly-L-Lysine-Fe2O3/SiO2 nanoparticles loaded with small interference RNA: Application to silencing gene expression in primary rat neurons. J. Nanosci. Nanotechnol. 2014; 14(4): 2810–5.
6. Payette D.J., Xie J., Shirwany N. and Guo Q. Exacerbation of Apoptosis of Cortical Neurons Following Traumatic Brain Injury in Par-4 Transgenic Mice. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2008; 1(1): 44–56.
7. Bingham D., John C.M., Panter S.S. and Jarvis G.A. Post-injury treatment with lipopolysaccharide or lipooligosaccharide protects rat neuronal and glial cell cultures. Brain Res. Bull. 2011; 85(6): 403–9.
8. Yu A.C., Lee Y.L. and Eng L.F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J. Neurosci. Res. 1993; 34(3): 295–303.
9. Desclaux M., Teigell M., Amar L., Vogel R., Gimenez y Ribotta M., Privat A. et al. A novel and efficient gene transfer strategy reduces glial reactivity and improves neuronal survival and axonal growth in vitro. PLoS One. 2009; 4(7): e6227.
10. He Y., Li H.L., Xie W.Y., Yang C.Z., Yu A.C.H. and Wang Y. The presence of active Cdk5 associated with p35 in astrocytes and its important role in process elongation of scratched astrocyte. Glia. 2007; 55(6): 573–83.
11. Khodorov B.I., Storozhevykh T.P., Surin A.M., Yuryavichyus A.I., Sorokina E.G., Borodin A.V. et al. The leading role of mitochondrial depolarization in the mechanism of glutamate-induced disruptions in Ca2+ homeostasis. Neurosci. Behav. Physiol. 2002; 32(5): 541–7.
12. Khodorov B.I., Mikhailova M.M., Bolshakov A.P., Surin A.M., Sorokina E.G., Rozhnev S.A. et al. Dramatic effect of glycolysis inhibition on the cerebellar granule cells bioenergetics. Biochem. Suppl. Ser. A Membr. Cell Biol. 2012; 6(2): 186–97.
13. Surin A.M., Khiroug S., Gorbacheva L.R., Khodorov B.I., Pinelis V.G. and Khiroug L. Comparative analysis of cytosolic and mitochondrial ATP synthesis in embryonic and postnatal hippocampal neuronal cultures. Front. Mol. Neurosci. 2013; 5: 1-15.
14. Dumollard R., Carroll J., Duchen M.R., Campbell K. and Swann K. Mitochondrial function and redox state in mammalian embryos. Seminars in Cell and Developmental Biology. 2009; 20(3): 346–53.
15. Nicholls D.G. and Ward M.W. Mitochondrial membrane potential and neuronal glutamate excitotoxicity: Mortality and millivolts. Trends in Neurosciences. 2000; 23(4): 166–74.
16. Duchen M.R., Surin A. and Jacobson J. Imaging mitochondrial function in intact cells. Methods Enzymol. 2003; 361: 353–89.
17. Сурин А.М., Шарипов Р.Р., Красильникова И.А., Бояркин Д.П., Лисина О.Ю., Горбачева Л.Р. и др. Нарушение функциональной активности митохондрий при МТТ-анализе выживаемости культивируемых нейронов. Биохимия. 2017; 82(6): 970-84.
18. Gerencser A.A., Chinopoulos C., Birket M.J., Jastroch M., Vitelli C., Nicholls D.G. et al. Quantitative measurement of mitochondrial membrane potential in cultured cells: calcium-induced de- and hyperpolarization of neuronal mitochondria. J. Physiol. 2012; 590 (12): 2845–71.
19. Trendeleva T.A., Rogov A.G., Cherepanov D.A., Sukhanova E.I., Il’yasova T.M., Severina I.I. et al. Interaction of tetraphenylphosphonium and dodecyltriphenylphosphonium with lipid membranes and mitochondria. Biochem. 2012; 77(9): 1021–8.
20. Dragunow M. High-content analysis in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 2008; 9(10): 779–88.
21. Mattiazzi Usaj M., Styles E.B., Verster A.J., Friesen H., Boone C. and Andrews B.J. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends in Cell Biology. 2016; 26(8): 598–611.
22. Daub A., Sharma P. and Finkbeiner S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 2009; 19(5): 537–543.
23. Репин В.С., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В., Горкун А.А., Зурина И.М., Кубатиев А.А. 3D технология сборки и поддержания одиночных дормантных микросфер из 2000 соматических клеток человека с их вторичной репаративной активацией in vitro. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2014; 3: 161-9.
24. Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Зурина И.М., Горкун А.А., Борзенок С.А., Никишин Д.А. и др. Технология создания мультипотентных сфероидов из мезенхимных стромальных клеток лимба для репарации поврежденных тканей глаза. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2016; 60(4): 160-7.
25. Thangnipon W., Kingsbury A., Webb M. and Balazs R. Observations on rat cerebellar cells in vitro: influence of substratum, potassium concentration and relationship between neurones and astrocytes. Dev. Brain Res. 1983; 11(2): 177–89.
26. Gallo V., Kingsbury A., Balázs R. and Jørgensen O.S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J. Neurosci. 1987; 7(7): 2203–13.
27. Budd S.L. and Nicholls D.G. A reevaluation of the role of mitochondria in neuronal Ca2+ homeostasis. J. Neurochem. 1996; 66(1): 403–11.
28. Sasaki S., Warita H., Abe K. and Iwata M. Impairment of axonal transport in the axon hillock and the initial segment of anterior horn neurons in transgenic mice with a G93A mutant SOD1 gene. Acta Neuropathol. 2005; 110(1): 48–56.
29. Popov V., Medvedev N.I., Davies H.A. and Stewart M.G. Mitochondria form a filamentous reticular network in hippocampal dendrites but are present as discrete bodies in axons: A three-dimensional ultrastructural study. J. Comp. Neurol. 2005; 492(1): 50–65.
30. Knöferle J., Ramljak S., Koch J.C., Tönges L., Asifc A.R., Michel U. et al. TGF-β 1 enhances neurite outgrowth via regulation of proteasome function and EFABP. Neurobiol. Dis. 2010; 38(3): 395–404.
31. Tonges L., Planchamp V., Koch J. C., Herdegen T., Bähr M. and Lingor P. JNK isoforms differentially regulate neurite growth and regeneration in dopaminergic neurons in vitro. J. Mol. Neurosci. 2011; 45(2): 284–93.
Опубликован
2018-05-30
Как цитировать
Лисина О. Ю., Московцев А. А., Кубатиев А. А., Сурин А. М. Динамика изменений морфологии нейрональной сети и развития митохондрий в механически поврежденной первичной культуре нейронов // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2018. Т. 62. № 2. С. 11–23.
Выпуск
Раздел
Оригинальные исследования
