Индуцированные глутаматом и ишемией изменения ионного гомеостаза в нейрональной культуре и коре головного мозга мышей, экспрессирующих Cа²⁺-сенсор GCaMP6f

Аннотация

Актуальность. При исследованиях внутриклеточного сигналинга и межнейрональной передачи сигнала в мозге в норме и при патологии все большее применение находят трансгенные животные, экспрессирующие в нейронах флуоресцентный Са²⁺-сенсор. Вместе с тем, пока недостаточно исследовано, насколько изменения кальциевого гомеостаза в интактном мозге соотносятся с гораздо более подробно изученными изменениями этого важнейшего параметра в нейроглиальных культурах, служащих модельными системами живого мозга. Целью работы было на модели ишемического инсульта выяснить в какой степени изменения внутриклеточной концентрации Са²⁺ ([Ca²⁺]) в мозге трансгенной мыши, измеренные с помощью флуоресцентного белкового сенсора GCaMP6f, соотносятся с изменениями [Ca²⁺] в первичных нейроглиальных культурах из кортекса этих животных. Методы. Методом широкопольной оптической нейровизуализации (ШОН) измерены изменения концентрации свободного Са²⁺ в цитозоле нейронов ([Ca²⁺]_c) головного мозга мышей. Измерения проводили перед и после фотоиндуцированного инсульта в сенсомоторной зоне коры. Изменения [Ca²⁺]_c отслеживали по флуоресценции GCaMP6f, экспрессируемого в нейронах кортекса. На первичных нейроглиальных культурах из коры головного мозга мышей той же линии проверено влияние эксайтотоксических доз глутамата (Glu) на [Ca²⁺]_c и на изменения средней концентрации свободного Са²⁺ в цитои нуклеоплазме ([Ca²⁺]_i). Измерения [Ca²⁺]_i выполнены методом флуоресцентной микроскопии с использованием синтетических Са²⁺- индикаторов Fura-2 и Fura-FF. В культивируемых нейронах дополнительно к измерениям кальциевого гомеостаза выполнены измерения внутриклеточного рН (pH_i), митохондриального потенциала (ΔΨm) и эндогенной флуоресценции NADH. Результаты. Фотоиндуцированная ишемия вызывает сильный рост [Ca²⁺]_c в зоне облучения ~1,1 мм² (n=9). В течение суток область высокой [Ca²⁺]_c расширяется до ~6 мм², но к 7-м сут практически возвращается к размерам необратимого повреждения. В нейроглиальных культурах из коры головного мозга мышей этой же линии кинетика изменений [Ca²⁺]_c, индуцированных Glu, напоминает кинетику [Ca²⁺]_i, однако [Ca²⁺]_c имеет значительно меньшую амплитуду при развитии отсроченной кальциевой дисрегуляции (ОКД). Сопоставление изменений [Ca²⁺] и pH_i показывает, что различия могут быть обусловлены тушением флуоресценции GCaMP6f при закислении цитозоля в результате эксайтотоксического действия Glu. Заключение. Сопоставление сигналов экспрессируемого нейронами Са²⁺-сенсора GCaMP6f в мозге и синтетических Са²⁺-индикаторов в первичных нейроглиальных культурах, полученных из животных той же линии, показывает, что феномен ОКД, впервые обнаруженный в культурах, вероятно, реализуется и в нейронах целого мозга при инсульте. Вместе с тем, необходимо учитывать, что относительные изменения [Ca²⁺]_c на разных стадиях развития ишемического повреждения и последующего восстановления мозга после фотоиндуцированного инсульта, могут быть искажены за счет влияния pH_i на флуоресценцию белкового сенсора.